不同真空處理時(shí)間對(duì)辣根過氧化物酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

　　辣根過氧化物酶經(jīng)真空處理不同時(shí)間，利用圓二色光譜研究不同真空處理時(shí)間對(duì)辣根過氧化物酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：在3~15 min 時(shí)間內(nèi)，不同真空處理時(shí)間對(duì)辣根過氧化物酶的α- 螺旋、β- 折疊、β- 轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲相對(duì)含量產(chǎn)生不同程度的影響，但是影響程度較小，表明辣根過氧化物酶二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)力學(xué)作用具有較高的穩(wěn)定性。

　　離子注入技術(shù)作為有效改善材料表面性能的表面改性技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體材料摻雜，金屬、陶瓷、高分子聚合物等諸多材料的表面改性中。20 世紀(jì)80 年代，中國科學(xué)家進(jìn)行了低能離子注入生物體效應(yīng)的研究與探索，研究結(jié)果已被成功地應(yīng)用于農(nóng)作物改良、細(xì)胞刻蝕和轉(zhuǎn)基因工程等方面。低能離子注入生物體效應(yīng)機(jī)理的研究也取得了部分結(jié)果，理論上提出了低能離子與生物體作用時(shí)的能量沉積、質(zhì)量沉積、動(dòng)量交換和電荷交換等四因子觀點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)上發(fā)現(xiàn)了低能離子注入對(duì)酶活性的影響、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的誘變作用以及致使DNA 堿基多位點(diǎn)、高密度變異等。這些結(jié)果為離子注入生物效應(yīng)提供了重要的理論依據(jù)。但是由于離子束技術(shù)本身的原因，離子束對(duì)樣品的處理是在真空中進(jìn)行的。那么，真空本身對(duì)生物體是否存在影響，是值得探討的問題。

　　酶在生命活動(dòng)過程中，扮演著極其重要的角色。理論研究表明，酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)對(duì)酶的功能至關(guān)重要，即使極其細(xì)微的擾亂，也能夠極大地影響酶的活性。酶蛋白不是剛性分子，它的功能依賴于結(jié)構(gòu)的這種運(yùn)動(dòng)性。光譜技術(shù)是研究生物蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種有效途徑，其中圓二色(Circular Dichroism 簡寫為CD)光譜可以靈敏地反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化,已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究中。

　　本文以HRP(辣根過氧化物酶)為研究對(duì)象，將酶蛋白置于離子注入時(shí)的真空條件下在不同時(shí)間，研究不同真空處理時(shí)間對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果對(duì)離子注入生物體效應(yīng)的機(jī)理分析與應(yīng)用研究具有重要的意義。

1、材料與方法

1.1、材料

　　辣根過氧化物酶結(jié)晶粉末(購自于北京拜爾迪生物技術(shù)公司，RZ≥3.0 單位酶活/mg)。主要試劑：30% 過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等。

1.2、實(shí)驗(yàn)設(shè)備

　　離子注入機(jī)（中國科學(xué)院等離子物理研究所）、圓二色光譜儀（Jasco- 715 型，日本Jasco 公司）、紫外- 可見分光光度計(jì)（VIS- 723G 型，北京瑞利分析儀器公司）、精密酸度計(jì)（PHS- 2C 型，上海康儀儀器有限公司）、電子天平（BP310S 型，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3、實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1、樣品的處理

　　取一定質(zhì)量的測(cè)試樣品放置于培養(yǎng)皿中,樣品面積約6 cm2。將樣品置于離子注入機(jī)靶室中對(duì)樣品進(jìn)行處理，待真空度達(dá)到10- 3 Pa 時(shí)（離子注入真空條件）開始計(jì)時(shí)，真空處理樣品時(shí)間分別取t＝3 min，6 min，9 min，12 min 和15 min。

1.3.2、 CD 譜測(cè)定

　　CD 光譜分析的酶液濃度為0.2 mg/ml（使用0.05 mol/L，pH=7.3 的PBS 溶解）。石英樣品池的光程為0.1 cm，靈敏度為2 mdeg/cm，掃描測(cè)定波長范圍為190~250 nm，掃描時(shí)間0.5 s,掃描速度為3.3 nm/s，分辨率為0.01 mdeg，在室溫下進(jìn)行測(cè)定。CD 譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為deg·cm2·dmol- 1，所有圓二色數(shù)據(jù)經(jīng)四次掃描取平均值。得出CD 譜后，用Selcon3[8,9]軟件計(jì)算辣根過氧化物酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

3、討論

　　蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架中局部肽段的構(gòu)象，α- 螺旋和β- 折疊結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，導(dǎo)致規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的剛性；β- 轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲中不存在氫鍵或其它的相互作用，使肽段中的各個(gè)殘基間有更大的自由度，沒有剛性，從而表現(xiàn)出極大的柔性。蛋白質(zhì)分子中α- 螺旋、β- 折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部的氫鍵。氫鍵在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中，尤其是二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成中非常重要。水分子的存在可以增加氫鍵形成的幾率，真空處理辣根過氧化物酶過程伴隨脫水的過程。由于水分子的減少，形成氫鍵的幾率降低，因此蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化。本文研究結(jié)果表明，真空對(duì)辣根過氧化物酶作用過程中，α- 螺旋、β- 折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲使隨著不同真空處理時(shí)間的增加，呈非單調(diào)型變化，但是變化幅度不大。表明辣根過氧化物酶二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)力學(xué)作用具有較高的穩(wěn)定性。在3～15 min 的真空條件下，辣根過氧化物酶經(jīng)真空處理后其相對(duì)活性基本上降低。這可能是由于真空作用對(duì)HRP 高級(jí)結(jié)構(gòu)的微擾，使HRP 活性中心卟啉環(huán)的微結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致HRP 的相對(duì)活性降低。

　　我們的研究結(jié)果表明，在離子注入生物效應(yīng)的研究中，應(yīng)該考慮真空對(duì)生物體所產(chǎn)生的影響，不能完全歸之于注入離子的生物效應(yīng)。